تولید پروتئین کایمریک tir: espa از e. colio157h7 در گیاه توتون تراریخت

چکیده اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از عوامل بیماری زایی مهم انسان و دام می باشد. اتصال باکتری به سلول میزبان، اولین گام در تثبیت و بیماری زایی است که به واسطه سیستم ترشحی نوعiii صورت می گیرد. در این میان espa به عنوان اصلی ترین جزء تشکیل دهنده سیستم ترشحی ارتباط تنگاتنگی با اتصال اولیه ی باکتری به سلول میزبان دارد. . espa به سبب ساختار خود و قرار گرفتن آن در غشاء خارجی باکتری، یک ایمنی زای قوی می باشد. tirنیز پروتئینی است که پس از بیان در باکتری و از طریق سیستم ترشحی نوعiii به سلول میزبان منتقل و در غشاء آن مستقر می شود و نقش مهمی در اتصال باکتری به میزبان دارد. سیستم های بیان گیاهی به دلیل هزینه ی پایین تولید، انجام تغییرات پس از ترجمه ای مشابه سایر سلول های یوکاریوتی، تشکیل ساختار صحیح پروتئین تولیدی و عدم آلودگی محصولات به عوامل بیماری زای انسانی، توالی های سرطان زا، پریون ها، جایگزینی مناسب برای سیستم های بیانی مرسوم محسوب می شوند. بیان آنتی ژن عوامل بیماری زایی میکروبی و ویروسی در گیاهان جهت تولید واکسن های خوراکی مطلوبیت ویژه ای دارند. به ویژه اینکه سلول های گیاهی به عنوان میکروکپسول های طبیعی از آنتی ژن های واکسن هنگام عبور از دستگاه گوارش محافظت می کنند. پروتئین های ایمونوژنیک کلیدی عوامل بیماری زا می توانند در بافت های گیاهی بیان شده و به عنوان واکسن خوراکی به انسان یا حیوانات ارزشمند اقتصادی خورانده شود. دریافت دهانی واکسن به دلیل هزینه کمتر و انجام ساده تر جایگزین جذاب و مناسبی برای تزریق می باشد. همچنین شانس دست یافتن به ایمنی مخاطی علیه عوامل عفونی که از این سطوح وارد می شوند با دریافت دهانی افزایش می یابد. در این تحقیق برای تهیه ی سازه ی ژنی حاوی قسمت های ایمنی زایespa(e) وtir(t) که با استفاده از یک رابط پپتیدی به یکدیگر متصل شده بودند از روش soeing pcr استفاده گردید. این ژن مصنوعی براساس کدون های گیاه بهینه سازی شد. در ادامه سازه ی فوق جهت همسانه سازی به ناقل pjet منتقل گردید. پس از اطمینان از صحت همسانه سازی از طریق توالی یابی، سازه ی دوتایی et جایگزین ژن gus در ناقل بیانی گیاهی شد و تحت کنترل پیشبرنده دائمی camv 35s قرار گرفت. سپس ساختار تهیه شده به agrobacterium tumefaciens وارد گردید و از آن برای تراریختی ریز نمونه های توتون استفاده گردید. پس از دو روز هم کشتی توام با اگروباکتریوم روی محیط هم کشتی، ریز نمونه ها به محیط باززایی انتخابی حاوی کانامایسین منتقل شدند.شاخساره های باززایی شده با اندازه ی مناسب به محیط ریشه زایی انتقال یافتند. تائید تراریختی گیاه با آزمون pcr و با آغازگر های اختصاصی صورت گرفت. برای تائید بیان ژن کایمریک et،در سطح رونویسی از آزمون rt-pcr استفاده شد.